以脂肪源性干细胞膜片构建组织工程皮肤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：细胞膜片技术以细胞自分泌的透明质酸及胶原蛋白做为内源性支架，能消除外源性支架的各种弊端。人脂肪源性干细胞结合细胞膜片技术用于全层皮肤缺损成为当前的研究热点。
目的：综述脂肪源性干细胞膜片研究现状及进展。
方法：计算机检索维普、PubMed数据库中1993年1月至2014年4月关于脂肪源性干细胞、细胞膜片技术及皮肤组织工程相关文章。在关键词中以“脂肪源性干细胞，创面愈合，组织工程皮肤，细胞膜片”或“adipose-derived stem cell, wound healing, tissue-engineered skin, cell sheet”为检索词进行检索。最终选择27篇文献进行分析。
结果与结论：来源于人废弃脂肪组织的脂肪干细胞具有成体干细胞的多向分化潜能和免疫相容性，可理想的用于再生医学。细胞膜片技术与传统的外源性可降解材料支架构建的组织相比具有多种优势。脂肪源性干细胞结合细胞膜片技术相结合，有利于组织血管化，能从多个方面促进创面愈合，其所分泌的细胞外基质层能提供适宜于细胞分化和生长的微环境，对全层皮肤缺损创面愈合具有正调控作用，可望构建真正的3-D化组织工程皮肤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 脂肪源性干细胞, 创面愈合, 皮肤缺损, 细胞膜片, 血管化, 透明质酸, 胶原蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Wtih hyaluronic acid and collagen by cell autocrine as endogenous scaffolds, cell sheet technology can eliminate the disadvantages of exogenous scaffolds. Human adipose-derived stem cells combined with cell sheet technology used in the study of full-thickness skin defects have become the current hot spot.
OBJECTIVE: To summarize the research progress in adipose-derived stem cell sheet.
METHODS: Articles related to adipose-derived stem cells, cell sheet technology and tissue-engineered skin were retrieved in VIP information and PubMed database from January 1993 to April 2014. The key words were “adipose-derived stem cell, wound healing, tissue-engineered skin, cell sheet” in English and Chinese, respectively. Totally 27 relevant articles were analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells derived from discarded human adipose tissue are immmunocompatible and multi-potent, rendering them ideal for regenerative medicine applications. Cell sheet technology seemingly provides several advantages over traditional tissue reconstruction with biodegradeable scaffolds. Adipose-derived stem cells combined with cell sheet technology can enhance tissue vascularization, promote wound healing, the secreted extracellular matrix provides the microenvironment for the cell differentiation and growth, so it is expected to build a real three-dimensional tissue-engineered skin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: stem cells, fat, hyaluronic acid, collagen

中图分类号:

R318

肖斌，刘毅. 以脂肪源性干细胞膜片构建组织工程皮肤[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(33): 5361-5365.

Xiao Bin, Liu Yi. Tissue-engineered skin constructed by adipose-derived stem cell sheet[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(33): 5361-5365.

图/表（结果） 1

2.1 细胞膜片(内源性支架组织工程)技术的特点组织工程皮肤的构建常用的支架材料有天然和人工可解材料两大料，种子细胞种植在支架上形成组织工程皮肤。目前已商品化的组织工程皮肤如Integra其内层是由牛Ⅰ型胶原与6-硫酸软骨素构成的海绵状网格，Derm agraft是将由新生儿包皮中获得的成纤维细胞种植于可降解聚乳酸网上构成，Aligraft是将体外培养的Kc膜片与含Fb的牛Ⅰ型胶原真皮基质相结合^[3]。良好的支架材料应具有以下特征：①有良好的组织相容性。②可降解并有适宜的降解速率，无明显毒性和炎症反应。③有适合的孔径及理想的三维空间结构。④具有相当的生物力学强度。但迄今为止仍未能找到一种理想的外源性支架材料，降解速率与细胞生长速度不适宜，降解时产物可以造成炎症反应，细胞在支架材料上的不均匀分布，都导致难以形成皮肤的空间结构。

细胞膜片技术是指在体外将细胞连续培养，而使细胞复层生长形成一种只由细胞和细胞外基质组成的膜片。这一技术已经广泛应用于组织工程研究当中，于1993年日本学者Okano等^[4]首先报道，将聚N-异丙基丙烯酰胺应用到细胞培养上，应用特殊的外源性温敏聚合物材料提取完整的细胞聚集体，用于组织工程构建。现有研究表明细胞膜片可以经体外培养以简单的方式收获，并不需要象Okano报道的需要一种特殊的温敏材料，通过温度变化来收获细胞^[5]。

组织工程中所应用的外源性支架生物材料对种子细胞贴附、增殖、分泌基质等方面均有影响，尤其是生物材料不均匀的降解速率、免疫反应、细胞的不均匀分布等因素，都限制了组织工程的进一步发展。细胞膜片关键优势是在于利用细胞自分泌的丰富的细胞外基质形成内源性支架，从而避免了外源性支架所带来的各种弊端。细胞所分泌的细胞外基质中含有胶原蛋白和透明质酸，能提供良好的微环境并从促进成纤维细胞增殖，对皮肤缺损创面愈合具有正调控作用^[6]，其细胞与细胞之间由细胞外基质自然地连接，结构上与皮肤组织类似，便于细胞之间的信号传导，排除材料的干扰，有利于在体外环境下细胞表型保持稳定。培养所形成的细胞膜片具有一定的机械强度，可以用细胞刮刀方便的从培养皿底部分离下来，可以卷曲、折叠，具有相当理想的可操作性，培养过程中无需酶类进行消化，因而避免了对细胞和细胞间连接的损伤。

对于皮肤组织工程来讲，细胞膜片技术能构造较厚的3D组织，因而与其他技术相比能更好的血管化^[7]。血管发生是组织工程皮肤的重要因素，Liu等^[8]构建含有毛细血管网的无支架双层组织工程皮肤。将真皮成纤维细胞和真皮微血管内皮细胞以2∶1比例进行共培养，20 d后形成的纤维膜片中可观察到毛细血管样结构。再将表皮细胞接种于纤维膜片组装成双分子层结构，7 d后苏木精-伊红染色证实组织工程皮肤具有层化的表皮，免疫组化染色表明上皮可以促进血管样结构形成，经透射电镜分析为标准的微血管。ELISA证实由于双层结构中的3种不同类型的细胞相互作用，血管化相关生长因子表达明显上调。

细胞外基质是组织工程和再生医学理想的生物材料，能提供适宜于细胞分化和生长的微环境，对全层皮肤缺损创面愈合具有正调控作用^[6]，细胞膜片的特点之一就是细胞可以自分泌丰富的细胞外基质形成内源性支架。Mineo等^[9]将人工真皮浸入到混有高分子透明质酸、低分子透明质酸和热变性的胶原溶液中，冻干后获得双层海绵状结构(Ⅰ型)。采用同样的方式，在溶液中加入表皮生长因子，构成含有表皮生长因子的双层人工真皮(Ⅱ型)。体外研究表明现两者都能促进成纤维细胞产生血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子，只是后者作用更为明显。动物实验采用大鼠烧伤模型，将大鼠背部皮肤浸入到沸水中3 s造成深度烧伤，3 d后切除坏死组织，将人工真皮应用于创面，7 d后观察生成创面床的能力，然后再进行自体皮肤移植，研究表明两者都能从促进血管发生并且抑制炎症反应，能形成良好的创面床从而接受自体皮肤移植。Kim等^[10]将人脂肪组织进行脱细胞化处理得到细胞外基质膜片，这种膜片呈多孔状结构，具有良好的理化特性。将其作为支架，种植人表皮细胞，人主动脉平滑肌细胞，人软骨细胞，人脐带血管内皮细胞和人脂肪源性干细胞，这些细胞在支架上分布均匀，增殖良好并且能与支架良好整合，进一步研究表明，这种工程化组织能明显促进创面愈合。

与传统的细胞-支架构建相比，细胞膜片技术的优点在于：①种子细胞利用效率高，细胞与细胞外基质复合体可直接用于组织构建，通过叠层实现三维构建。②细胞间的连接以片状形式托附，保留了基质中细胞与细胞间连

接、细胞表面蛋白等，使细胞生物学行为和功能得以维持。③细胞膜片技术与其他技术相比能更好构造血管化3D组织。④细胞膜片可以模拟天然的组织结构，在复合其他材料的时候可以极大的增加细胞的利用效率，因而有可能形成类似皮肤组织由多种细胞构成多样化的组成^[11]。

2.2 脂肪源性干细胞在组织工程皮肤构建中的应用目前用于构建组织工程皮肤常用的种子细胞主要有自体细胞和干细胞。自体细胞包括表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞；干细胞包括表皮干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、毛囊干细胞和脂肪源性干细胞^[12]。皮肤的结构较为复杂，由表皮、真皮和皮下组织构成，含有角质形成细胞、纤维母细胞、黑素细胞、郎格汉斯细胞等多种细胞成分，附属结构中有毛发、皮脂腺和汗腺，此外还有血管、淋巴管及神经等多种结构。因此，要构建真正的皮肤组织异常困难，由单一细胞成分培养的薄层细胞层曾有应用于临床的报道，但由于缺乏真皮组织，具有不耐磨擦，易破溃，瘢痕多，挛缩重及易感染等缺点，无法满足需求。自体细胞取材损伤大，体外扩增能力有限，难以大面积应用，而干细胞由于具有多向分化潜能和自我更新能力，使其在组织工程皮肤构建中成为首选种子细胞^[13-14]。脂肪干细胞最早由Zuk从脂肪组织中分离，与骨髓间充质干细胞形态相似，其平均倍增时间约为60 h，并且能保持稳定的倍增率直至13代，在不同的培养条件下可分化为不同来源的组织细胞，与其他干细胞相比有显著的优越性，表现在：①脂肪细胞易于获得，可以避免从骨髓获取细胞时造成的损伤。②患者本身来源的细胞能够进行自体移植，可以克服异体的排斥反应。③脂肪源性干细胞在体外增殖速度快，不必进行永生化处理就能获得足够量的细胞用于移植。④对于体质量超重而又需组织工程种子细胞进行治疗的患者，只需进行腹部的吸脂术就可获得足量的脂肪组织用于培养。鉴于以上优点，脂肪源性干细胞在组织工程皮肤的构建中得到越来越广泛的研究^[15]。

Brzoska等^[16]研究发现，全反式维甲酸可诱导脂肪间充质干细胞定向分化为表皮细胞，免疫荧光检查显示脂肪间充质干细胞诱导分化后角蛋白K18阳性。Maharlooei^[17]的研究证实脂肪源性干细胞促进伤口愈合和抗老化作用是通过活化真皮成纤维细胞和角质形成细胞。Kim等^[10]指出干细胞治疗能建立适宜的皮肤替代物来加强新生组织血管化，脂肪源性干细胞促进创面愈合的潜在机制是通过血管源性因子产生和血管新生，研究表明脂肪源性干细胞膜片能增加创面的血管密度。脂肪源性干细胞容易获得，可以来源于腹部手术时废弃的人脂肪组织，或者是通过微创的吸脂方式而大量获得，具有免疫相容性和多向潜能，因而使其理想的用于再生医学。此外，脂肪干细胞的获取也避免了许多伦理问题。

目前认为，脂肪源性干细胞拥有最高的增殖和分化能力，其次是来源于骨髓和软骨的间充质干细胞。现有的研究表明，脂肪源性干细胞在创面修复中的应用有以下几个方面：①自体脂肪源性干细胞移植增加全厚皮移植成活率，可用于皮肤移植外科。其原因是脂肪源性干细胞可原位分化成为血管内皮细胞，增加血管内皮生长因子和转化生长因子β3分泌。②通过直接细胞-细胞接触和旁分泌方式激活生长因子的分泌，从而促进皮肤成纤维细胞增殖。③通过直接的细胞-细胞接触促进人真皮成纤维母细胞分化和分泌。④脂肪源性干细胞能用于治疗光老化和皮肤愈合。⑤脂肪源性干细胞在糖尿病大鼠模型中，能增加创面的愈合率并且降低成纤维母细胞的数值密度。⑥脂肪源性干细胞修复创面的模型中，有角蛋白的表达并鉴定了上皮面毛囊的存在。角质形成细胞和乳头细胞也许对全层皮肤缺损创面的毛囊发生起到重要诱导作用^[1^，^18-19]。

由于异体来源种子细胞的免疫排斥反应问题没有得到解决，使干细胞移植、组织工程局限于个体化治疗的范畴，而不能在临床上广泛应用。脂肪干细胞不但具有成体干细胞的多向分化潜能，而且以其来源广、数量充足、易于扩增和免疫原性低等优点，使异源性组织工程器官(如皮肤等)的构建成为可能。

2.3 脂肪源性干细胞膜片构建组织工程皮肤的优势皮肤含有表皮角质细胞，成纤维细胞，皮肤附属组织和细胞外基质等多种成分，脂肪源性干细胞经研究证明可促进成纤维母细胞的分化、促进成纤维细胞的增殖，并有可能转化成为角质细胞。“无支架材料皮肤组织工程”技术的核心是细胞分泌基质，基质包埋着细胞的仿生三维构建模式，具有特殊的细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用优势，同时能提供适宜于细胞分化和生长的微环境，在组织工程领域应用这一技术的主要的优势是能定制工程化新生组织，比如形成由成纤维细胞、表皮细胞和脂肪间充质干细胞的混合膜片，这样的结构更接近于天然的皮肤结构^[20]。国内刘娜等^[21]用大鼠脂肪间充质干细胞体外构建细胞膜片，结果表明细胞膜片组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子表达水平高于正常培养的脂肪源性干细胞组，这同时证实这一技术可能通过促进细胞因子的分泌影响皮肤愈合。

当前皮肤替代物一个限制就是不良的血管化问题，而脂肪源性干细胞与细胞膜片技术相结合能很好的改善这一问题。Lin等^[1]从来源于废弃的人腹部皮下脂肪组织中分离出的脂肪源性干细胞进行培养，将其嫁接于纤维蛋白培养皿构建单层细胞膜片和3层细胞膜片。体外实验证实，细胞膜片能轻易地用镊子从培养皿上分离，脂肪源性干细胞特征性基因表达显示FABP4和PPAR-γ基因表达在细胞膜片和成熟脂肪细胞间有显著差异，基因表达在细胞膜片和2D培养的细胞相比无明显差异。体外实验包括将将单层膜片，3层膜片移植于祼鼠全层皮肤缺损创面并观察3周时间，于7，10，14，21 d测量面积评估创面愈合。结果表明，除了21 d的时间点，脂肪源性干细胞膜片处理组创面大小明显小于对照组。与单层膜片组在7，10，14 d时相比，3层膜片组加强了创面愈合速度，组织学检查证实脂肪源性干细胞细胞膜片通过加强细胞分化和迁移来起到促进伤口愈合的作用。人A/C蛋白免疫染色证实人脂肪源性干细胞在术后第21天在祼鼠体表仍然存活。此外，在脂肪源性干细胞细胞膜片治疗组可以检测到更多的新生胶原。血管密度分析证实脂肪源性干细胞细胞膜片治疗组轻度促进了血管增生，单层与3层膜片组总血管量与对照组相比，分别增加约15%和22.5%。苏木精-伊红染色表明角质形成细胞增殖并迁移到新生真皮的外围，这一现象对角质形成细胞能高度增殖并迁移到伤口边缘的理解相一致，从而能在短时间内闭合创面，恢复表皮屏障功能。Cerqueira等^[22]采用获得于热敏感细胞培养表面技术获得人脂肪间充质干细胞膜片，将其叠加后形成3层膜片结构，移植到大鼠全层缺损延迟愈合创面。由于具有天然的黏附特性，与标准方法获得的表层细胞相比较，脂肪源性干细胞膜片更加稳定。结果表明移植的脂肪源性干细胞膜片能促进新生组织血管化，并且广泛影响表皮形态发生，能观察到成熟程度较高的表皮突的存在，同时还有显著数量的毛囊，更进一步证膜片结构促进内在的细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用，考虑这主要是通过对宿主细胞的旁分泌作用，证实脂肪源性干细胞膜片从不同方面影响皮肤再生，比如新生血管形成但主要是表皮形态发生。McLaughlin等^[23]构建单层和3层脂肪源性干细胞膜片，用于大鼠全层皮肤缺损创面修复，在第7，14，18天时间点，观察到脂肪源性干细胞膜片愈合速度优于对照组，而3层脂肪源性干细胞膜片组效果更为明显。他们认为这种内源性支架的细胞膜片技术在创面愈合领域对临床和科研都具有重要意义，今后的方向可以集中在创面床血管生成，加入多种不同类型的细胞和同种异体细胞膜片的研究。

3 小结 Conclusion

在广泛的皮肤修复或再生的方法中，干细胞组织工程被视为最有希望的途径，细胞膜片工程具有特殊的细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用优势，及其具有的细胞环境，能建立3D组织工程结构来促进全层皮肤缺损创面的再生。干细胞或分裂进行自我更新，或进入分化途径成为成熟的分裂群体(干细胞非对称性取代特性)，通过非对称性复制，分化成多种组织类型因而有可能构建复杂组织结构，从而克服单一的皮肤替代物，用于损伤皮肤修复和再生^[27]。

传统的组织工程设计集中在用可降解的外源性支架支撑组织形成，然而生物可降解支架仍存在许多临床挑战，细胞膜片技术就是基于对上述不利因素的不断研究而产生的。从目前的研究来看，干细胞膜片技术已开始应用于骨、韧带和皮肤组织工程。干细胞膜片用于伤口愈合是由于其具有自我组装能力，使其能生成血管和皮肤等同物，同时培养细胞膜片的过程中，不需要用胰蛋白酶或中性蛋白酶收集细胞，从而避免了对细胞的损害或丢失分化表型。细胞膜片技术具有多种优势，从而超越传统再生治疗技术，比如干细胞注射和含有生物降解材料的组织重建技术。脂肪间充质干细胞膜片能从多个方面促进创面愈合，其所分泌的细胞外基质层能提供适宜于细胞分化和生长的微环境，对全层皮肤缺损创面愈合具有正调控作用。目前对于脂肪源性干细胞膜片研究较少，处于起步阶段，将脂肪源性干细胞与细胞膜片技术相结合，通过内源性支架利于细胞生长及血管形成的作用，加上脂肪间充质干细胞膜对皮肤愈合的调控作用，有望能进一步加快创面的愈合速度和能力，降低创面愈合时间，减少瘢痕形成，达到理想的愈合效果。

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引言

皮肤是机体与外界环境接触的屏障，起到防止外界损伤，参与体温调节，防止体液外渗，参与免疫反应及代谢、分泌等作用。皮肤缺损通常由不同深度的烧伤、创伤、擦伤、溃疡或肿瘤术后所致，目前临床治疗的手段多样化，包括皮肤和皮瓣移植，手术清创，负压封闭引流(VSD)，物理治疗，异体皮肤移植，外用新型敷料及组织化工程皮肤等，但这些方法或造成新的创伤或最终导致创面瘢痕化愈合，特别是对于大面积皮肤缺损或慢性难愈性创面仍缺乏有效的治疗方案。在广泛的皮肤修复或再生的方法中，组织工程被视为最有希望的途径。当前已有商品化组织工程皮肤替代物应用于临床，但这些以传统的种子细胞联合支架材料构建的替代物存在微生物污染，引流差，缺乏机械张力，起水疱，愈合时间长和欠缺美容效果的缺点，其原因在于：一是缺少皮肤组织含有的各种成分，皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，含有表皮角质细胞，成纤维细胞，皮肤附属组织和细胞外基质等多种成份，现有的皮肤替代物多以表皮细胞和(或)成纤维细胞构建，是一种单一的皮肤替代物，没有自我分化和血管化能力；二是所应用的外源性可降解的支架材料可以引起炎症反应，细胞在支架材料上分布不均匀，同时由于不良的血管化导致皮肤替代物中央的细胞坏死，难以真正形成3-D化结构^[1-2]。

近年来，寻求采用无外源性支架的干细胞膜片技术构建组织工程皮肤替代物成为研究热点。细胞膜片以细胞自分泌的透明质酸和胶原蛋白做为内源性支架，细胞自身均匀分散于三维结构中，同时保留了细胞与细胞间连，使细胞生物学行为和功能得以维持。此外细胞膜片能更好促进血管形成，细胞外基质具有促进创面愈合的能力，因此符合良好的细胞支架所应具有的多种优点。干细胞可以通过非对称性复制分化成多种组织类型，有可能构建复杂组织结构。脂肪源性干细胞具有多向分化潜能，同时具有来源丰富，低免疫原性，体外扩增方便等特点，还可以通过分泌多种生长因子，如血管内皮生长因子、胎盘生长因子和肝细胞生长因子，亦能通过旁分泌作用于成纤维细胞，使其分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，促进表皮细胞的再生，促进创面愈合及组织血管化，因而成为近期来皮肤组织工程中研究的热点。将脂肪源性干细胞与细胞膜片技术相结合，能更好的联合这些优势，从而建立3-D化皮肤替代物来促进皮肤缺损创面的再生，文章对这一方面的研究现状及新进展作一综述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

讨论

尽管目前组织工程皮肤仍存在各种问题，如安全性，临床效果及使用方便性等方面，但其在生物医学领域的广泛应用和发展潜力，使其仍然是研究的热点之一。目前常用的有表皮替代物、真皮替代物和复合皮替代物，但这些产品均不具备完整的皮肤功能，特别是缺乏毛囊、皮脂腺、汗腺等附属结构，也没有达到真正的皮肤重建作用。理想的皮肤替代物应具备以下条件：具有良好的3-D结构，可以快速的血管化和神经再分布，具有良好的外形、韧性和机械性能，其中的细胞成分能完成自身增殖并向皮肤中各种细胞成分分化^[24-26]。在广泛的皮肤修复或再生的方法中，干细胞组织工程被视为最有希望的途径，细胞膜片工程具有特殊的细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用优势，及其具有的细胞环境，能建立3D组织工程结构来促进全层皮肤缺损创面的再生。干细胞或分裂进行自我更新，或进入分化途径成为成熟的分裂群体(干细胞非对称性取代特性)，通过非对称性复制，分化成多种组织类型因而有可能构建复杂组织结构，从而克服单一的皮肤替代物，用于损伤皮肤修复和再生^[27]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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